探究细胞外囊泡介导的snoRNAs和核糖体转运在关节衰老中的作用

【项目介绍】 衰老导致肌肉骨骼组织，尤其是软骨的显著退化，进而引发骨关节炎。小核仁RNA（snoRNAs）和细胞外囊泡随年龄发生变化，可能通过改变核糖体功能和转运调控RNA货物来驱动软骨退化。我们提出，EV介导的snoRNA和核糖体转运促进了与年龄相关的关节退变。

与年龄增长相关的组织功能退化是一个新兴的临床挑战。大量研究报道了组织中与年龄相关的细胞和分子变化。然而，肌肉骨骼组织的研究严重不足。尽管如此，与年龄相关的肌肉骨骼退化和退行性疾病（如骨关节炎）在很大程度上导致了老年人残疾的高发生率（影响65岁以上人群的30-60%）和整体医疗支出。

软骨是关节的重要组成部分，为关节运动提供光滑、润滑的表面，并充当减震器。随着年龄增长，软骨发生显著变化，包括细胞数量减少、细胞外基质成分改变和硬度增加。这些变化促进了骨关节炎的发展，其特征是软骨分解、疼痛和关节功能减退。

小核仁RNA作为健康和疾病中细胞过程的重要调控因子正在兴起。snoRNAs是一类高度进化保守的小非编码RNA。经典意义上，snoRNAs指导核糖体RNA的位点特异性修饰（2'-O-甲基化和假尿苷化），从而精细调控核糖体功能。此外，许多snoRNAs具有非经典功能，指导其他RNA种类的修饰并调控基因表达。

我们已报道了snoRNAs在关节健康和疾病、人类和马骨关节炎及衰老软骨、马衰老滑液、小鼠骨关节炎关节和血清、人间充质干细胞以及软骨分化中的差异表达。这些数据表明snoRNAs在衰老中的表达发生改变。基于我们先前的发现，我假设snoRNAs通过调控核糖体、精细调控细胞翻译以及通过其他非经典机制，是衰老的关键驱动因素。

细胞外囊泡是一组异质性的分泌膜囊泡，其货物包含DNA、RNA、蛋白质、脂质和代谢物。它们促进细胞间通讯，在组织稳态、（病理）生理过程和衰老中发挥作用。研究表明，细胞分泌的EV数量及其内容物在衰老过程中发生变化。我们已证明关节细胞通过EV交换snoRNAs，甚至可能交换核糖体亚基和完全组装的核糖体。

我们假设EV转运snoRNAs和核糖体成分（甚至可能是功能性核糖体），促进软骨的年龄相关变化，推动骨关节炎发展。

【研究目标】 • 确定从年轻和年老软骨细胞分离的EV中的snoRNA谱 • 描述来自年轻和年老软骨细胞的EV中的rRNA和核糖体蛋白货物 • 研究通过EV转移的核糖体成分在软骨细胞中的作用及其对细胞翻译和功能的影响

【研究方法】 研究设计：本博士项目将采用混合方法，结合定量和定性研究方法。

细胞分离和培养：使用已建立的方案从年轻和年老马分离马原代软骨细胞。

EV隔离和表征：使用尺寸排阻色谱法从年轻和年老软骨细胞的细胞培养基中隔离EV，并通过纳米颗粒追踪、电子显微镜和CD9、CD81、CD63的Western blot进行表征。

衰老软骨细胞中的EV货物： • RNA测序：从年轻和年老软骨细胞的EV中分离总RNA并进行snoRNA测序。 • 质谱蛋白质组学：使用质谱无标记定量评估EV货物中包括核糖体蛋白变化在内的蛋白质变化。 • 核糖体和多核糖体分析：使用翻译能力评估技术确定EV中是否存在完整的核糖体亚基（40S和60S）、完全组装的功能性核糖体（80S）和多核糖体。

体外翻译实验：为评估EV核糖体的翻译能力，将采用无细胞体外翻译实验。兔网织红细胞裂解液将去除内源性核糖体并用EV-核糖体样品重构。在标准条件下，在重精氨酸和重赖氨酸存在下进行翻译，用于后续基于SILAC的蛋白质组学分析。

蛋白质合成检测：使用SILAC，我们将检测体外翻译反应中蛋白质的从头合成。重点将放在鉴定从头合成的β-珠蛋白蛋白和与EV-核糖体共分离的mRNA编码的其他蛋白质。

【预期成果】 本研究将提供关于EV介导的snoRNA转移在软骨衰老中作用的宝贵见解，并阐明核糖体成分在EV中是否具有功能。通过实现上述目标，本研究将有助于填补现有文献的空白，并为未来软骨衰老机制研究提供参考。